Técnicas

La reacción en cadena de la polimerasa, ya más conocida como PCR, es una técnica que permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el término que se ha impuesto) pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. Por su alta sensibilidad, esta técnica permite identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide.

PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA.

El método se basa, en su forma más simple en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas.

• Desnaturalización

94-95°C por 45 segundos si G+C < 55%.

• Temperatura de hibridación (Annealing)

Debe ser calculada o determinada empíricamente para cada par de “primers” o cebadores.

Demasiado alta = poco o nada de producto.

Demasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos.

• Extensión

A la temperatura óptima del ADN polimerasa utilizada

Ej.: 72°C para Taq -------> 1 min/kb de longitud, dado que la Taq polimeriza 2000 pb/min

Nota: solo a partir del 3er ciclo son producidos ADN duplex de la longitud deseada, los cuales a partir de allí se tornan en el producto principal.

Dado que el ARN usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es necesario hacer una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR. La transcripción reversa genera una copia de la hebra de ARN, pero esta copia es ADN complementario (ADNc) el cual es estable al calor y puede resistir la metodología de la PCR.

Frecuentemente usada para la detección de agentes infecciosos ej: virus ARN.

Puede ser usada para construir bibliotecas de ADNc.

Los pasos de la RT-PCR son:

• Unión del cebador a la secuencia de ARN objetivo
• Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del cebador mediante la incorporación de nucleótidos complementarios.
• Fin de transcripción reversa, se obtiene la hebra del ADNc complementario al ARN.
• Se realiza la PCR.

RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción). Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la detección de fragmentos de ADN de distinto peso molecular o de tallas diferentes (por digestión con enzima de restricción). Se utiliza para diferenciar o genotipificar microorganismos mediante el análisis de patrones derivados de cortes en el ADN.

Cuando se emplea la PCR para amplificar fragmentos de ADN y después enzimas de restricción, se le denomina PCR-RFLP. Y es ampliamente utilizada para genotipificar virus como los Virus de Papilloma Humano, Virus de Hepatitis C entre otros.

• GENOTIPIFICACIÓN POR RFLP descrito por Davidson y cols., J,G.Virol, 76, 1995.

Con esta metodología es posible la detección de la presencia de dos o más microorganismos en forma simultánea en una sola reacción. Esta modificación permite descartar rápidamente la infección por los patógenos habitualmente responsables de los cuadros que se quiere diagnosticar. Para poder aprovechar todas las ventajas de esta técnica, es necesario respetar cuidadosamente las instrucciones de toma de muestra, conservación y condiciones para el envío al laboratorio ya que es una reacción muy sensible a la presencia de inhibidores y contaminantes.

• Describe una PCR en la cual hay presentes múltiples pares de primers lo que da una serie de productos. Los mismos pueden verse como múltiples bandas en un gel de agarosa.
• Multiplex PCR es frecuentemente usada en diagnóstico médico.
• Ahorra muestra, tiempo y gastos.
• Requiere una cuidadosa optimización.

PCR Múltiple de VIRUS SYNCYTIAL RESPIRATORIO A y B, INFLUENZA A, B y C

Esta modificación consiste en una amplificación de una parte de un producto de una reacción de PCR realizada con anterioridad. El producto obtenido está comprendido dentro de la secuencia del producto de la primera ronda. Esta modificación permite aumentar significativamente la sensibilidad y la especificidad de la reacción de la PCR.

• A veces 1 ronda de PCR no da un producto único debido a que partimos de un templado complejo, o queremos mejorar la sensibilidad. Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco más internamente que los primeros, realizando una segunda ronda de PCR usando el producto de la primera.
• Rinde un producto único porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios de hibridación para el segundo par de primers.

La PCR a tiempo real combina con los nuevos sistemas automáticos para la purificación de ácidos nucleicos, ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas moleculares para la identificación y cuantificación de agentes infecciosos de interés clínico.

Esta tecnología se basa en la detección de la emisión de fluorescencia durante cada ciclo de amplificación, lo cual permite el monitoreo continuo de la reacción de PCR. Un rayo láser excitador es transmitido a la muestra por una fibra óptica.

En la PCR a tiempo real, los procesos e amplificación y detección se producen de manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Mediante la detección por fluorescencia se puede medir durante la amplificación la cantidad de ADN formado.

Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos:

1. Agentes intercalantes.

2. Sondas específicas marcadas con fluorocromos.

Son fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hélice. El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un aumento proporcional de la fluorescencia emitida. Este sistema de detección tiene la ventaja de que la optimización de las condiciones de la reacción es muy fácil. Su inconveniente es su baja especificidad, debido a que se unen de manera diferente a productos generados inespecíficamente, para mejorar esto, se deben emplear condiciones de reacción óptimas y una selección de cebadores para disminuir el riesgo a formar dímeros.

Son sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor. El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia entre las dos moléculas.

Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis o TaqMan, las sondas moleculares beacons y sondas FRET; las de hidrólisis son oligonucleótidos marcados con un fluorocromo donador con el extremo 5’ que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor en el extremo 3’ que absorbe la fluorescencia liberada por el donador. Las moléculas deben estar próximas, si la sonda está intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor; durante la amplificación de ADN diana, la sonda híbrida con su cadena complementaria.

Las sondas moleculares beacons son parecidas a las de hidrólisis, tienen una molécula donadora en el extremo 5’ y una aceptora en el 3’, pero presentan una estructura secundaria en forma de asa, en la que reside la secuencia de unión específica con el ADN diana. Los extremos permanecen plegados cuando la sonda no está hibridada, lo que conlleva que el donador y el aceptor estén muy cerca, por ello la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por el equipo, pero al hibridar con el ADN diana la sonda se abre, alejándose donador y aceptor, pudiendo ser detectada la fluorescencia emitida por el primero.

Las sondas FRET, se compone de dos sondas que se unen a secuencias adyacentes del ADN diana. Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3’ y la otra un aceptor en el extremo 5’. Cuando las sondas están hibridadas, los dos fluorocromos están próximos. Al ser excitado, el donador transfiere su energía al aceptor, que a su vez, emite la fluorescencia que detecta el lector del equipo.

El empleo de sondas garantiza la especificidad de la detección y permite identificar polimorfismos o mutaciones puntuales.

La PCR a tiempo real, ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas moleculares, debido a sus indudables ventajas, como la facilidad de empleo, gracias a su rapidez, permiten un flujo mucho mayor de muestras y de ensayos, otra ventaja es que al utilizar sistemas cerrados, el riesgo de contaminación disminuye de forma muy importante. Además permite cuantificar la concentración inicial de ácido nucleico presente en las muestras de forma más precisa y sencilla.

Actualmente se tienen kits disponibles para el diagnóstico de los agentes infecciosos de mayor interés mediante sistemas de PCR a tiempo real como (VIH, VHB, VHC, Citomegalovirus), también hay enfermedades de menor interés comercial, en las que el uso de métodos moleculares de diagnóstico aporta indudables ventajas.